Olink蛋白多因子检测是一种基于邻近延伸分析（Proximity Extension Assay，PEA）技术的高通量蛋白质定量方法，主要用于在少量生物样本中同时检测多种蛋白质的表达水平。在生物标志物发现、疾病机制研究、药物开发及临床队列研究等领域，该技术因其能够精准检测低丰度蛋白而受到关注。与传统的ELISA或质谱方法相比，Olink可以在仅需1～3微升样本的前提下，一次性检测数十至数千种蛋白，为研究人员提供更全面的蛋白表达谱信息。目前，该技术已在癌症早筛、免疫炎症研究、心血管疾病及神经科学等多个方向得到应用。 该技术的核心原理是PEA，它将抗体识别的高特异性与核酸扩增的高灵敏度相结合。针对每个目标蛋白，设计一对抗体，分别连接独特的DNA寡核苷酸标签。当这两支抗体同时与目标蛋白的相邻表位结合时，DNA标签在空间上靠近并发生杂交，形成可被扩增的DNA模板。随后，通过微流控qPCR或二代测序对DNA扩增产物进行定量，DNA产量与样本中目标蛋白的含量成正比，从而实现对蛋白的精准定量。这种双抗体识别机制有效避免了非特异性交叉反应，使得检测灵敏度可达到fg/mL级别，动态范围覆盖10个数量级以上。以下从主要特点、应用领域和样本操作注意事项三个方面展开介绍。
一、主要技术特点
1.高通量检测能力：根据不同的检测平台，单次实验可检测48种至5400种以上的蛋白，覆盖炎症、肿瘤、免疫、心血管、代谢及神经科学等多个生物学通路。
2.超高灵敏度：检测下限可达fg/mL水平，尤其适合检测血浆、血清、脑脊液等体液中的低丰度蛋白，如细胞因子、趋化因子及激素等。
3.样本用量极少：每次检测仅需1～3微升样本，适用于珍贵或难以采集的样本类型，如儿童血浆、组织穿刺样本或脑脊液。
4.数据可比性好：输出结果为标准化蛋白表达值（NPX，Normalized Protein Expression），便于不同样本、不同批次及不同实验室之间的数据比较。
5.无需复杂前处理：样本无需变性、酶解或富集，直接稀释后即可上机检测，操作流程相对简便。
二、主要应用领域
1.疾病生物标志物发现与验证：在癌症（肺癌、乳腺癌、结直肠癌等）、自身免疫病及神经退行性疾病中，筛选用于早期诊断、预后评估或疗效预测的蛋白标志物组合。
2.药物研发支持：用于药物靶点发现与验证、药效学评价、安全性监测及药物适用人群的精准分层。
3.炎症与免疫研究：检测细胞因子风暴、免疫治疗相关反应（如CAR-T治疗后的IL-6升高）、慢性炎症性疾病的免疫网络变化等。
4.大规模队列研究：适用于数千人级别的人群队列样本检测，结合基因组学、代谢组学开展多组学联合分析。
5.液体活检与早筛：通过血液、血浆等液体样本检测多种蛋白标志物，辅助实现疾病的早期筛查和风险评估。
三、样本操作注意事项
1.样本类型选择：推荐使用EDTA抗凝血浆，血清也可使用但部分蛋白表达可能存在偏差。避免使用肝素抗凝剂，因其可能干扰后续扩增反应。
2.采集与保存要求：采血后应在30分钟内完成离心分离血浆，分装后立即置于-80℃长期保存。避免反复冻融，原则上冻融次数不超过1次。
3.避免溶血与脂血：溶血样本中的游离血红蛋白会干扰扩增反应，应设定溶血评分阈值，必要时剔除不合格样本。
4.样本批次与随机化：在大规模研究中，应将不同分组的样本随机分配到不同的检测板上，避免分组样本集中在同一板次，以减少批次效应。
5.质控与验证：建议引入QC样本和内参监控跨板一致性。对于通过Olink筛选出的差异蛋白，可使用ELISA或靶向质谱（PRM/MRM）进行绝对定量验证。
Olink蛋白多因子检测技术以其高通量、高灵敏度及低样本需求的特点，在蛋白质组学研究领域提供了一种区别于传统方法的思路。需要指出的是，该技术输出的NPX值为相对定量指标，在临床转化或需要绝对浓度的场景中，应通过ELISA等方法进行验证。此外，Olink并非完全替代质谱技术，二者在实际应用中形成互补——Olink适合大规模、靶向性的低丰度蛋白筛查，而质谱则在非靶向发现和翻译后修饰分析方面具有优势。研究者应根据自身的研究目标、样本规模及预算，合理选择适用的平台和检测面板，以获得可靠且具有生物学意义的结果。
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